上海酶联生物在我司原代细胞操作中，我们都认为实验的原理似乎很简单，不外乎固定抗原，添加一抗、二抗和底物，间中夹杂着洗涤和封闭。 

　　原代细胞培养实验步骤：

 

　　1、取7-10d雄性SD大鼠，颈椎脱臼处死,浸泡于75%乙醇消毒3-5min。
 

　　2、在超净工作台中，将大鼠断头置于玻璃培养皿中，打开颅腔后取出全脑,放在盛有预冷的PBS玻璃培养皿中，去除小脑和间脑。
 

　　3、将大脑半球在干滤纸上缓慢滚动以去除软脑膜和脑膜大血管，再放在新的盛有预冷的PBS玻璃培养皿中。
 

　　4、用细解剖镊去除大脑白质、残余大血管和软脑膜，保留大脑皮质。
 

　　5、大脑皮质放于DMEM中(含庆-大霉素和谷-氨酰胺 )，剪碎成约1mm3大小，放入50ml的离心管中，加入混合酶液I(0.05-0 .1%II型胶原酶，0 .025-0 .05%IV型胶原酶，200-400U DNaseI)，混匀后37℃水浴消化1-1.5h。
 

　　6、室温1 000×g离心8min，去上清液。
 

　　7、沉淀中加入20%BSA重悬浮，充分混匀，1 000×g，20min，4℃离心，去上清。
 

　　8、沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1%的胶原酶/分散酶，0.05-0.1%I型胶原酶，100-300U DNaseI )重悬浮，混匀，37℃水浴消化0.5-1h，700×g室温离心6min，去上清液。
 

　　9、沉淀加入2ml DMEM(含庆-大霉素和谷-氨酰胺)培养液悬浮混匀，铺于经离心形成连续梯度的12ml 50%Percoll(25 000×g，60min，4℃)，1000×g，4℃离心10min。
 

　　10、靠近底部的红细胞层之上的白的层面即为纯化的微血管段，吸出后DMEM
 

　　加入DMEM*培养液(20%FBS，4ug/ml嘌呤霉素 )重悬浮，接种于含5%的大鼠 血清37℃孵育过夜所制备的细胞培养皿中，置于37℃、5%CO2培养箱内静置培养24h后更换不含嘌呤霉素的混合培养基，随后隔天换液。
 

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